脉冲场凝胶电泳分析Bt菌质粒谱的方法 
,
黄飞燕1,2 
,
李莉1,2 ,
赵从2 ,
朱锦天2
2海南省热带农业资源研究所，三亚，海南，中国
作者 通讯作者
基因组学与生物技术, 2014 年, 第 3 卷, 第 2 篇 doi: 10.5376/gb.cn.2014.03.0002
收稿日期: 2014年05月15日 接受日期: 2014年06月11日 发表日期: 2014年06月18日
Zhou, 2014, Protocol for Analyzing Plasmid Profiles of Bacillus thuringiensis by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Bt Research, 2014, Vol.5, No.1, 1-4 (doi:10.5376/bt.2014. 05.0001)
Bt菌株一般含有1个到10多个大小不等的质粒，分子量在10 Kb至600 Kb以上不等。Bt菌株的质粒谱特征是鉴定Bt菌株的重要依据。用常规的电泳凝胶方法分离分子质量大于25 kb的质粒DNA分子是很难的，而脉冲场琼脂糖电泳技术(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分离鉴定质粒谱的理想的选项之一。PFGE的原理主要是利用有规律的改变电场方向和大小，从而使大分子DNA得以分离。我们通过对10个Bt菌株大质粒的分离鉴定的基础上提出了本实验方法，利用本PFGE实验方法能对Bt菌株质粒的数量、大小以及单个大质粒的分离获得理想的实验结果。
Bacillus thuringiensis，简称Bt，是革兰氏阳性、芽孢形成菌，归属到芽孢杆菌属的Bacillus cereus sensu latu亚组。Bacillus cereus sensu latu亚组包含 B. Cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, 和 B. weihenstephanensis六个成员组成，与Bacillus cereus亚组其他成员相比，这些菌株的显著不同之处在于质粒数量、功能的不同。Bt菌株一般含有数个大小不等的质粒，分子量均在10 Kb至 600 Kb以上不等(Wang, 2011)。研究表明大多数Bt伴胞晶体蛋白的编码基因定位于大质粒上。
由于普通的琼脂糖电泳只能分析DNA分子质量小于25 kb的DNA分子，因此，要分离分子质量大于25 kb的质粒DNA分子，理想的选择是脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)。PFGE是利用两个交变电场交替地开启和关闭，使DNA分子泳动方向随着电场的变化而发生改变，其独具的高分辨力使其广泛应用于生物基因组织结构的研究。
我们通过对10个Bt菌株大质粒的分离鉴定的基础上提出了本实验方法，利用本PFGE实验方法能对Bt菌株质粒的数量、大小以及单个大质粒的分离获得理想的实验结果。
1仪器设备及操作
本研究使用的主要实验仪器是美国BIO-RAD公司的CHEF Mapper® XA Pulsed Field Electro- phoresis System，是目前脉冲场凝胶电泳中应用最广泛的CHEF装置，可分离高达7 000 kb的DNA分子，包括电泳槽、动力系统、可变速率泵和冷却系统。该装置有三对电极，提供了一个相当均一的电场，使凝胶中所有的条带都是直线前移，从而为针对胶槽边缘及无效电极的扭曲提供了解决方法。
操作规程如下：
(1) 检查冷凝系统，确认管道连接密封，不漏气。
(2) 在电泳槽中加入约2.2L合适体积的电泳缓冲液。
(3) 接通主机和冷凝泵电源，开启主机开关，主机自检结束后开启冷凝系统开关按“set temp”键调节需要的电泳温度，按“actual temp”显示实际温度，调节泵的速度为“100”左右。
(4) 将加好样的凝胶连同底座一起放入电泳槽内的黑色背景处，要保证电泳液超过胶面1~2 mm，将冷凝泵速度调节至“50”，以防凝胶被冲走。
(5) 在主机上设置电泳程序(最简单的办法是按“auto algorithum”键，设置欲得到的线性范围的最大和最小kb值 ，确认所有给出参数)，按“start”键进行电泳。此时可观察到电泳槽内电极开始出现气泡。
(6) 电泳开始，“high voltage”灯亮，此时切不可打开电泳槽盖进行操作，以免发生触电危险。
(7) 电泳结束，“high voltage”灯灭，依次关掉冷凝系统、主机开关，然后取出凝胶，最后清除使用过的电泳液，再用蒸馏水冲洗电泳液循环系统，晾干。
一般情况下，1~3步在电泳前半小时进行。
2培养基、化学试剂及配置
本实验使用的Seakem Gold Agarose由Cambrex公司生产 ，Agarose Ⅲ、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)购于上海生工生物工程有限公司，氯化钠、乙二胺四乙酸、异丙醇等购于国内其他生物试剂公司。
(1) LB培养基配方及制备参照Zhou等(Zhou et al., 2013)。
(2) Solution A: 2 M Nacl 50 mL, 100 mM Tris-cl (pH 7.5)50 mL
(3) Solution B: 10 mM EDTA(pH 8.0); 25 mM Tris-cl (pH 8.0); 2% Lysozyme; 75 μg/mL RNAase
(4) ESP: 0.5 M EDTA (pH 8.0); 1% SLS; 1 mg/mL蛋白酶K
(5) TE (含1 mM PMSF): 10 mM Tris-cl (pH 7.5); 1 mM EDTA (pH 8.0); 1 mM PMSF
(6) TE: 10 mM Tris-cl (pH 7.5); 1 mM EDTA (pH 8.0)
(7) 10 mM PMSF: 1 mg PMSF溶于1mL异丙醇中，分装并放于-20℃储存(注意: PMSF, 剧毒, 小心使用)。
